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當(dāng)前位置:首頁 > 產(chǎn)品中心 > 細(xì)胞生物學(xué) > 報(bào)告基因 > AC19L021/AC19L022雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒

簡要描述:李記生物Firefly & Renilla雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒具有檢測迅速、靈敏度高、檢測范圍廣,無細(xì)胞內(nèi)源活性干擾等特點(diǎn)。

  • 產(chǎn)品型號(hào):AC19L021/AC19L022
  • 廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
  • 更新時(shí)間:2024-08-07
  • 訪  問  量:1678

詳細(xì)介紹

品牌其他品牌CAS/
分子式/純度/
分子量/貨號(hào)AC19L021/AC19L022
規(guī)格100T/10*100T供貨周期現(xiàn)貨
主要用途通過熒光素酶活性的高低來判斷藥物處理等對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。應(yīng)用領(lǐng)域生物產(chǎn)業(yè)
產(chǎn)品描述

      螢火蟲熒光素酶是一種分子量約為61 kD 的蛋白,在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下,可以催化Luciferin 氧化成Oxyluciferin,在Luciferin 氧化的過程中,會(huì)發(fā)出生物熒光(Bioluminescence)。海腎熒光素酶是一種分子量約為36 kD的蛋白,在氧氣存在的條件下,可以催化Coelenterazine 氧化成Coelenteramide,在Coelenterazine 氧化的過程中也會(huì)發(fā)出生物熒光。生物熒光可以通過化學(xué)發(fā)光儀(Luminometer)或液閃測定儀進(jìn)行測定。


  在 DLR 檢測中,螢火蟲(Firefly)熒光素酶和海腎(Renilla)熒光素酶的活性可在單個(gè)樣品中依次檢測。先是先以熒光素(Luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase),后以腸腔素(Coelenterazine)為底物來檢測海腎熒光素酶(Renilla Luciferase),并在后續(xù)加入海腎熒光素酶底物時(shí),同時(shí)加入抑制螢火蟲熒光素酶催化Luciferin發(fā)光的物質(zhì),使后續(xù)檢測僅僅檢測到海腎熒光素酶的活性,實(shí)現(xiàn)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測。通過熒光素酶和其底物這一生物發(fā)光體系,可以非常靈敏、高效地檢測基因的表達(dá)。通常把感興趣基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5' 啟動(dòng)子區(qū)克隆在Luciferase 的上游,或把3'-UTR 區(qū)克隆在Luciferase 的下游等,構(gòu)建成報(bào)告基因(Reporter Gene)質(zhì)粒,然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞,用適當(dāng)藥物等處理細(xì)胞后裂解細(xì)胞,測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低來判斷藥物處理等對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。 Renilla Luciferase 相對(duì)更多地被用作轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參,以消除細(xì)胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的差異。

  具有檢測迅速、靈敏度高、檢測范圍廣,無細(xì)胞內(nèi)源活性干擾等特點(diǎn)。


訂購信息


產(chǎn)品名稱貨號(hào)規(guī)格
Firefly & Renilla雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒AC19L021100 T
Firefly & Renilla雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒AC19L0221000 T


試劑盒組分

試劑盒組份100T1000T
A.5× Passive Luciferase Lysis Buffer10 mL100 mL
B.Firefly Luciferase Assay Buffer10 mL100 mL
C.D-Luciferin 2 mg20 mg
D.Renilla Luciferase Assay Buffer10 mL100 mL
E.50× Coelenterazine200 µL2 mL


保存方法

藍(lán)冰運(yùn)輸。-20℃保存,有效期12個(gè)月。

【注】:C組分建議預(yù)先使用B組分配制為2 mg/mL儲(chǔ)液,B組分、D組分及配制為儲(chǔ)液的C組分,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行小批量分裝。所有檢測工作液建議現(xiàn)配現(xiàn)用,避免反復(fù)凍融。

使用方法
1.細(xì)胞裂解
(1)將轉(zhuǎn)入報(bào)告基因的細(xì)胞中的培養(yǎng)基移除,加PBS 輕輕洗滌兩次(貼壁細(xì)胞可直接進(jìn)行此操作,懸浮細(xì)胞要離心收集細(xì)胞)。按如下方案加入 1×Lysis Buffer (用無菌水按 4:1 稀             釋 A 組分), 然后將培養(yǎng)板放在微型震蕩器上室溫震蕩 15 min,充分裂解細(xì)胞。

細(xì)胞培養(yǎng)板96孔板48孔板24孔板12孔板6孔板
細(xì)胞裂解液30 µL60 µL120 µL250 µL500 µL


 注:裂解產(chǎn)物可室溫保存 6 h,-70℃可長期存放(裂解產(chǎn)物不能多次反復(fù)凍融)。如果熒光素酶的表達(dá)水平比較低,可以嘗試使用更少的裂解液,例如6孔板的每孔用量可以小為  100μL。

(2)將充分裂解后的裂解產(chǎn)物,10000-15000 rpm 離心 3-5 min。離心后將上清液移入新的 EP 管中進(jìn)行后續(xù)檢測。

(3)細(xì)胞裂解后可以立即測定熒光素酶,也可以先凍存,待以后再測定。凍存樣品需融解,并達(dá)到室溫后再進(jìn)行測定。


2. 工作液配制

(1)用B 組分充分溶解C 組分,配制成0.2 mg/mL的螢火蟲熒光素酶檢測液。

注:螢火蟲熒光素酶工作液不能反復(fù)凍融,若單次實(shí)驗(yàn)用量較少,建議按單次使用量分裝成小規(guī)格。

(2)用D組分將E組分稀釋成1× Coelenterazine工作液,稀釋方法為將1 µL E組分加入到49 µL D組分中,此稀釋方法可按比例相應(yīng)擴(kuò)大。


注:1× Coelenterazine工作液應(yīng)該現(xiàn)用現(xiàn)配。
3. 化學(xué)發(fā)光值檢測

(1)將上述配制好的螢火蟲熒光素檢測液和1× Coelenterazine工作液恢復(fù)至室溫。

(2)按儀器操作說明書開啟化學(xué)發(fā)光儀或具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀,將測定間隔設(shè)為2 s,測定時(shí)間設(shè)為10 s。

(3)每個(gè)樣品測定時(shí),取樣品20-100μL(如果樣品量足夠,請(qǐng)加入100μL;如果樣品量不足可以適當(dāng)減少用量,但同批樣品的使用量宜保持一致)。

(4)加入100μL螢火蟲熒光素酶檢測試劑,用槍打勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測定RLU(relative light unit)。以報(bào)告基因細(xì)胞裂解液為空白對(duì)照。

注:由于該發(fā)光為瞬時(shí)發(fā)光,建議加入螢火蟲熒光素酶檢測試劑后,立即進(jìn)行發(fā)光值的檢測。

(5)在完成上述測定螢火蟲熒光素酶步驟后,加入 100 μL海腎熒光素酶檢測工作液,用槍打勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測定RLU(relative light unit)。

(6)在以海腎熒光素酶為內(nèi)參的情況下,用螢火蟲熒光素酶測定得到的 RLU 值除以海腎熒光素酶測定得到的 RLU 值。根據(jù)得到的比值來比較不同樣品間目的報(bào)告基因的激活程度。如果以螢火蟲熒光素酶為內(nèi)參,也可以進(jìn)行類似計(jì)算。


注意事項(xiàng)
1. 為取得理想定效果,在用單管的化學(xué)發(fā)光儀測定時(shí),樣品和測定試劑混合后到測定前的時(shí)間應(yīng)盡量控制一致;使用具有化學(xué)發(fā)光測定功能的多功能熒光酶標(biāo)儀時(shí),宜先把樣品全部加好,然后統(tǒng)一加入螢火蟲熒光素酶檢測試劑。

2. 由于溫度對(duì)酶反應(yīng)有影響,所以測定時(shí)樣品和試劑均需達(dá)到室溫后再進(jìn)行測定

3. 為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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